O Seminário Maior de Anápolis teve início em 19 de março de 1980. Inicialmente funcionou na residência episcopal, sendo o seu primeiro Reitor Pe. Vittorio Lucchesi, ajudado pelo Pe. Heládio Alvarez Rodrigues, da Diocese de Santos – SP.
Foram os primeiros professores: Dom Manoel Pestana Filho, Pe. Vittorio Lucchesi, Pe. Edson Alves dos Santos, Pe. José Cardoso da Silva, da Diocese de Santos – SP, e Frei Beraldo Hanlon, OFM.
Após dois meses, passou para as instalações da Paróquia N. Srª. da Abadia, no bairro Vila Góis. Mais tarde, para a antiga escola paroquial de Santo Antônio.
No início de 1986, estando pronta a Casa do Sacerdote Idoso, no Bairro Alto da Bela Vista, foram para lá transferidos os seminaristas maiores, ficando os menores na Paróquia de Santo Antônio.
Depois foi transferido para as instalações do recém construído seminário no Mosteiro de Santa Cruz. Uma parte dos seminaristas estudou em Arujá – SP, no seminário dirigido pelos padres Legionários de Cristo. O Seminário Menor passou a funcionar em Arujá – SP, e no Seminário da Diocese de Petrópolis – RJ.
No início do ano 2004, o Seminário Maior foi transferido para as instalações próprias da Diocese, no Bairro Miranápolis. O reitor era o Pe. Dr. Ingo Dollinger e vice-reitores Pe. Andreas Dankl, ORC, e Pe. Peter Lechermann. De 2004 a 2010, o reitor foi o Pe. Eli Ferreira Gomes, do clero da Diocese de Anápolis. A partir de 2011 até 2017, o reitor foi o Revmo. Pe. Edmilson Luiz de Almeida. Até o ano de 2012, Seminário teve como vice-reitor e prefeito de estudos o Pe. Rogério Silva de Morais e como diretor Espiritual o Pe. Arnaldo Trindade de Souza. A partir de 2013, o vice-reitor e prefeito de estudos foi o Pe. Fábio Aparecido Barbosa, sendo substituído pelo Revmo. Pe. Diego Neves Spagnolo, que permaneceu no cargo nos anos de 2016 e 2017. No início do ano de 2018 foram nomeados para os cargos de Reitor e Vice-reitor, os padres Anevair José da Silva e João Paulo Cardoso de Moraes, respectivamente. Eles permanecem à frente do seminário até os dias de hoje.